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本制品是用于去除基因组DNA进行反转录的试剂盒。该试剂盒在42℃，2分钟即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制gDNA Eraser的组分，经过gDNAEraser处理后的样品可以直接进行逆转录反应合成cDNA。本试剂盒配有新型高效反转录酶HfScript，新颖突变位点大幅提升酶的转录活性，cDNA第一链合成的效率和产量更高，可利用pg级的总RNA或mRNA合成cDNA第一链。如逆转录产物cDNA用于下游荧光定量检测，可在42℃，15分钟完成逆转录反应。本试剂盒适用于第一链cDNA的合成和后续的RT-PCR、RT-qPCR、以及全长cDNA文库的构建等。

• 快速去除基因组：含有去除基因组DNA的gDNA Eraser，只需2分钟即可除去基因组DNA。
  
• 快速逆转录：15分钟即可获得荧光定量PCR模板cDNA第一链合成。
  
• 灵敏度高：可利用pg级总RNA或mRNA模板合成cDNA第一链。
  
• 高效的逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。

• 在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，使用专门的仪器和耗材。
  
• 逆转录体系配制在冰上进行操作，防止RNA发生降解。试剂盒的酶使用后尽快置于-20℃保存，并尽量避免反复冻融。
  
• 反应体系可倍比放大，10μL反应体系可最大使用1μg总RNA。
  
• Primer Mix由Oligo(dT)和Random primer配制而成，也可根据实验需要选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer。
  
• 对于二级结构复杂的RNA模板，建议在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5分钟立刻置于冰上，短暂离心后进行下一步操作。

• 去除基因组DNA反应
  
  • 根据以下表格在冰上配制反应体系，总体积为10μL。为了保证反应液配制的准确性，先按反应数+2的量配制预混体系，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。
    

    成分	用量
    10×gDNA Eraser Buffer	1μL
    gDNA Eraser	0.5μL
    RNA Template	10pg～1μg
    RNase-Free Water	至10μL

    注意：如果总RNA量大于1μg，请按比例扩大反应体系。若起始RNA的量小于50ng，则建议加入RNA酶抑制剂(货号：WE0223)。
    
  • 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
    
  • 42℃孵育2分钟（室温反应时，可以延长到30分钟）。
    
  • 反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
  
  
• 逆转录反应
  
  • 根据以下表格在冰上配制反应体系，为了保证反应液配置的准确性，先按数+2的量配制成预混溶液，然后再分装10μL到每个反应管中，取配制的预混液10μL加入至已完成去基因组的步骤A反应管中。
    

    成分	用量
    步骤A反应液	10μL
    HfScript反转录酶(200U/μL)	1μL
    Primer Mix	1μL
    5×ScriptRT Buffer	4μL
    RNase-Free Water	4μL

    注意：可根据实验需要可使用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，建议20μL反应体系Oligo-dT Primer 50pmol，或Gene Specific Primer 2pmol。
    
  • 混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
    
  • cDNA合成反应条件：
    
    • 若下游进行荧光定量PCR检测，42℃孵育15分钟，85℃孵育5分钟。
      
    • 若下游进行普通PCR检测，42℃孵育30～50分钟，85℃孵育5分钟。
      注意：对于二级结构复杂或GC含量高的模板，可以提高逆转录温度至50℃，增强逆转录效率。
  • 反应结束后，短暂离心后置于冰上，再进行后续PCR或荧光定量PCR，如果需要长时间保存，请置于-20℃。
    注意：进行Real-time PCR反应时，逆转录产物的加量应不超过PCR反应总体积的1/10。